周仁芳，胡朝*。抗中性粒细胞胞浆抗体的实验室检测进展。中华检验医学杂志,年12月第41卷第12期:-.
抗中性粒细胞胞浆抗体（anti-neutrophilcytoplasmicantibodies,ANCA）是以中性粒细胞及单核细胞的胞浆成分为靶抗原的自身抗体。自年由Davies等在节段性坏死性肾小球肾炎的患者血清中发现了ANCA，自此ANCA已成为小血管炎的生物学标志，主要存在于ANCA相关血管炎（ANCA-associatedvasculitis,AAV）患者中，如显微镜下多血管炎（microscopicpolyangiitis,MPA）、肉芽肿性多血管炎（granulomatosiswithpolyangiitis,GPA）及嗜酸性肉芽肿性多血管炎（eosinophilicgranulomatosiswithpolyangiitis,EGPA）。ANCA也可存在于炎症性肠病、自身免疫性肝病、系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等其他自身免疫病，以及淋巴瘤、感染性疾病及某些药物使用后等。ANCA的实验室检测方法通常包括间接免疫荧光法（indirectimmunofluorescenceassay,IIF）和针对其靶抗原的特异性自身抗体的各种免疫学方法。临床实验室检测ANCA及其特异性自身抗体，对疾病的诊断、鉴别诊断、分型、病情监测及预后判断等具有重要的临床意义[1-2]。近年来，随着生物医学技术的飞速发展和ANCA的临床推广应用，在临床实践中对ANCA的实验室检测及其临床应用带来新的机遇和挑战。
一、IIF检测ANCA
IIF作为最初发现ANCA的实验室检测技术，已成为ANCA最为经典的常规检测技术，开创了ANCA实验室检测的里程碑。IIF检测ANCA（IIF-ANCA）根据在乙醇、甲醛固定的人中性粒细胞实验室基质上呈现的荧光模型，通常分为胞浆型ANCA（cytoplasmicANCA,cANCA）、核周型ANCA（perinuclearANCA,pANCA）及不典型ANCA（atypicANCA,aANCA）。根据ANCA检测的相关国际共识[3-4]，以及最近国内达成的ANCA检测的临床应用专家共识[5]，更加明确了IIF是ANCA实验室检测的重要方法。但是，由于IIF-ANCA的准确性与实验室基质（包括固定方法）、荧光素标记的二抗结合物及实验操作（如孵育、清洗）等因素有关。另外，IIF-ANCA也存在方法学上的局限性，如实验操作的费时、费力及工作效率难以提高，特别是荧光结果判读的主观性影响、缺乏统一标准及特殊培训要求等。上述原因也在一定程度上限制了IIF-ANCA的临床实验室推广应用。对此，随着生物工程技术的不断发展，已可以提供IIF-ANCA的自动化方案。不仅包括实验操作的自动化（前处理），甚至能实现IIF-ANCA阴/阳性、荧光模型及滴度等自动判读。
Boomsma等[6]在ANCA特异性抗蛋白酶3（proteinase3,PR3）抗体阳性的GPA患者中，第一次使用IIF-ANCA自动判读技术，与人工判读的IIF-ANCA进行对比研究。虽然发现IIF-ANCA自动判读的符合率低于人工判读，但自动判读技术检测ANCA的滴度值增高可预测GPA患者的复发，其阳性预测值高于人工判读（69%/56%）。AKLIDES作为较早开发的IIF-ANCA自动化分析系统[7]，与人工判读的阴/阳性结果符合率可达89.1%。结合乙醇和甲醛固定的中性粒细胞实验基质，能自动鉴别cANCA、pANCA及aANCA荧光模型。但在判读cANCA和aANCA时，该自动化分析系统与人工判读存在部分差异。另外，Damoiseaux等[8]研究也表明，抗PR3抗体阳性的AAV患者中，IIF-ANCA自动判读系统在乙醇固定的中性粒细胞上的敏感性低于人工判读（74%/92%）；而在甲醛固定的中性粒细胞上的敏感性与人工判读基本一致（95%/97%）。ANCA特异性抗髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）抗体阳性的患者中，IIF-ANCA自动判读系统对乙醇固定的中性粒细胞上呈现的pANCA荧光模型识别能力较好，但对甲醛固定的中性粒细胞上呈现的胞浆型荧光模型识别较差。
同时，对于IIF-ANCA的实验室检测技术进展，还包括近年来建立的在同一反应体系中同时进行IIF检测ANCA及其特异性自身抗体（如抗MPO抗体、抗PR3抗体等）。如在同一生物芯片上针对不同实验基质（细胞、组织及抗原微点）所建立的生物芯片技术[9]。以及基于乙醇固定的中性粒细胞，包被MPO、PR3靶抗原的不同尺寸荧光微珠，建立的自动化多参数细胞微珠技术（automatedmultiplexCytoBeadtechnology）的数字IIF[10]。Csernok等[11]对MPA、GPA患者及疾病对照组进行基于上述两种新技术的相关研究，由于IIF-ANCA的自动判断性能与实验基质、识别模式定义有关。因此，此些新技术与传统方法比较，对MPA和GPA的诊断性能仍存在争议。
目前，IIF-ANCA自动化分析系统对ANCA阴/阳性判读具有较高的诊断效能，对典型的ANCA荧光模型具有较好的识别能力，能减少ANCA检测结果在实验室内、实验室间的差异，且能提高实验室对IIF-ANCA的工作效率。此项新技术也可避免人为判断ANCA滴度进行的血清稀释，从而对提高经济效益和工作效率具有重要的意义。甚至可实现IIF检测ANCA及其特异性自身抗体的同时检测。因此，IIF-ANCA的自动化是今后的发展方向，会对其标准化进展起重要的推动作用，但仍需要多中心的临床实践才能真正应用于常规检测。
二、ANCA特异性自身抗体检测
自ANCA被发现后，研究者使用酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）鉴定出MPO是pANCA的主要靶抗原，PR3确认为GPA患者cANCA的主要靶抗原。ANCA靶抗原除常见的MPO和PR3外，还包括其他靶抗原，包括人白细胞弹性蛋白酶（humanleukocyteelastase,HLE）、乳铁蛋白（lactoferrin,LF）、溶酶体（lysozyme,LYS）、组织蛋白酶G（cathepsinG,CathG）及杀菌/通透性增高蛋白（bactericidal/permeabilityincreasingprotein,BPI）等。由于针对其他靶抗原的特异性自身抗体的临床意义仍未十分明确，因此临床上主要检测抗MPO抗体和抗PR3抗体，其对AAV的分型、临床表现、治疗反应及预后具有重要的临床意义。
对于抗MPO抗体、抗PR3抗体的检测，从最初使用靶抗原直接包被微孔板的第一代ELISA检测技术（间接法），发展到使用单克隆抗体包被微孔板以结合靶抗原的第二代ELISA检测技术（捕获法），以及使用桥联分子包被微孔板以结合靶抗原的第三代ELISA检测技术（锚定法）。由于第二、三代ELISA检测技术的敏感性高于第一代[12]，且能够减少抗原包被过程中对其表位的影响作用，检测的抗PR3抗体与疾病的活动性存在较好的相关性[13]。因此，第二、三代ELISA检测技术可广泛应用于临床实验室的抗MPO抗体、抗PR3抗体检测。如目前主要用于抗PR3抗体的第三代ELISA检测技术，由于其优异的检测性能，甚至被誉为高敏感的ELISA检测技术[12]。
此外，ANCA特异性自身抗体检测亦从ELISA发展到高敏感性、易自动化的其他检测新技术，如线性免疫印迹法（Lineimmunoassay,LIA）、高通量流式免疫法（multiplexflowcytometricimmunoassay,MFIA）、化学发光法（chemiluminescentimmunoassays,CLIA）、荧光酶免疫法（fluorescent-enzymeimmunoassays,FEIA）等[14]。KaulR等[15]使用MFIA对抗MPO抗体和抗PR3抗体进行性能评价，此项新技术与ELISA比较，抗MPO抗体的阳性、阴性符合率分别为93.4%和99.2%，总体符合率为97.7%；抗PR3抗体的阳性、阴性符合率分别为93.1%和95.4%，总体符合率为94.4%。在pANCA中抗MPO抗体的阳性率为93.3%，cANCA中抗PR3抗体的阳性率为94.9%。MahlerM等[16]使用CLIA进行抗MPO抗体和抗PR3抗体的性能评价。与ELISA比较，抗MPO抗体的阳性、阴性符合率分别为%和85.7%，总体符合率为91.5%；抗PR3抗体的阳性、阴性符合率分别为%和92.5%，总体符合率为95.8%；抗PR3抗体量值变化与疾病活动性相关。此外，文献也报道[17]，抗PR3抗体的CLIA检测技术与第三代ELISA比较，第三代ELISA会存在对炎症性肠病患者检测抗PR3抗体假阳性情况。另外，上述技术平台开发的检测系统能实现自动化、定量、随时待机及急诊检测模式等。
总之，ANCA特异性自身抗体检测技术可采用多种免疫学方法，实现高敏感性、自动化及定量检测是其今后的发展方向。同时，随着ANCA特异性自身抗体检测新技术的临床应用，对于初诊的临床疑似AAV患者（GPA、MPA），使用上述高敏感性的免疫学方法检测抗MPO抗体、抗PR3抗体已可作为其筛查试验，而不一定使用IIF-ANCA[18]。
三、ANCA实验室检测程序的标准化
在ANCA实验室检测中，通常根据针对的靶抗原不同，分为IIF-ANCA的筛查试验及其特异性自身抗体检测的确认试验。由于不同的检测方法针对的靶抗原特点、敏感性及特异性差异，从而可造成IIF-ANCA与特异性自身抗体检测结果的不一致性。对此，关于ANCA实验室检测程序的标准化问题，一直为实验室、临床所困惑和