静脉注射人免疫球蛋白(pH4)
生产工艺、质量控制的演变及评价思考
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来源中国生物制品学杂志年11月第33卷第11期作者邱晓，罗建辉国家药品监督管理局药品审评中心关键词静脉注射免疫球蛋白；生产工艺；质量控制人血浆中含有约20种蛋白，其中大部分是白蛋白（35~40mg/mL），免疫球蛋白的浓度约为8~12mg/mL。血液中的免疫球蛋白分为IgG、IgA、IgM、IgD及IgE，前3者占比分别约为75%、15%、10%，根据亚型不同IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，不同亚型的IgG半衰期不同，IgG1、IgG2和IgG4的半衰期3~4周，IgG3的半衰期仅约2周。临床使用的人免疫球蛋白制品是从原料血浆（至少人份混合投产）中经分离纯化后获得的IgG混合物，具有广谱抗病*、细菌或其他病原体的功能，能迅速提高受者血液中IgG水平，增强机体的抗感染能力和免疫调节功能，可用于先天性丙球蛋白缺乏症、反复感染、器官移植后抗感染等。有研究表明，免疫球蛋白产品还能刺激某些T细胞亚群，从而促进T细胞增殖［1］。根据注射方式不同，免疫球蛋白制品分为肌肉注射免疫球蛋白（intramuscularimmunoglobulinG，IMIG）和静脉注射免疫球蛋白（intravenousimmunoglobulinG，IVIG），IVIG在纯度等质量属性要求相对IMIG更高。在过去30年间，随着IVIG的生产工艺及管理方式的改进，IVIG的产量和安全性有了较大提高，但IVIG输注相关的血栓栓塞事件（throm-boembolicevents，TEEs）仍时有发生，年，Octa-pharma公司由于其生产的5%IVIG产品出现了高于常规的TEEs，紧急召回了美国市场的31批产品［2］。因此，确保IVIG产品的质量既是对患者安全的保障，也是对血液制品生产厂家利益的保障。1IVIG生产工艺的发展
从血浆中分离IgG的方法始于20世纪40年代的乙醇沉淀法［1］，起初该工艺不包括额外的纯化步骤，导致分离的IgG单体纯度仅达70%~80%，其中含有大量的IgG聚体及IgA、IgM。这类产品在经肌肉注射时，表现出体液抗体的生物学功能，具有正常的生理半衰期，但肌肉注射的缺点是注射剂量小、注射部位局部刺激性强、吸收缓慢，当这类产品通过静脉给药，可引起危及生命的过敏性反应的发生，且发生概率较高，原因是免疫球蛋白聚体引起了非特异性自发补体激活反应。通过酶切或化学修饰处理，可降低免疫球蛋白在静脉给药时引起的自发的补体激活（如利用β-丙内酯处理会导致蛋白质烷基化和酰化，降低Fc片段补体激活功能），于是出现了化学修饰或酶切的静脉注射的免疫球蛋白产品。但经修饰的免疫球蛋白产品会被网状内皮系统迅速从循环中去除，缩短了循环半衰期，从而影响了免疫球蛋白的使用。第1代完整的免疫球蛋白产品是利用冷乙醇沉淀中的组分Ⅱ进行生产的，Ⅱ组分被溶解、过滤并经温和的酸处理（通常在pH4，37℃条件下孵育20h）后，再经微量胃蛋白酶处理以确保在不影响IgG完整性的前提下，消除产品引起的抗补体效应。20世纪70年代，人们已能够分离出完整且纯度大于99%的免疫球蛋白产品［3］。随着人们对免疫球蛋白产品工艺理解和产品质量的理解不断加深，现代免疫球蛋白生产工艺越来越多样化，且产品从原料血浆控制、纯化、制剂、质控等多方面不断完善［4］。2IVIG现代生产工艺及质控
2.1原料血浆的控制原料血浆的质量直接关系到免疫球蛋白的质量。为确保血液制品的安全，我国现有法律法规从不同层面提出了要求。首先在血浆站应对供浆者进行筛查，并在窗口期后进行供者复查；其次在血液制品生产企业，应对用于生产的每1份血浆进行复核检验，复检合格的样品要在检疫期过后才能投入生产，且应对混浆的样品进行检验。从原料血浆采集至产品应用于临床的整个过程均需与采浆站、生产企业及监管机构间建立良好的沟通、反馈机制，以确保能够适当地识别和处理安全性事件。血液制品生产商作为产品安全的责任主体，有责任对其采浆站进行有效地监督，确保原料血浆的采集、检验、贮存及运输均符合我国的法律法规，并按照现行法律法规对原料血浆进行复检和留样，这是生产出安全血液制品的前提。2.2原液生产工艺传统的IVIG生产工艺流程为：原料血浆于2~3℃受控的条件下冷沉淀，之后取冷沉淀的上清，通过色谱吸附分离凝血酶原复合物、抗凝血酶或C1-抑制剂的蛋白，经3~4个乙醇沉淀步骤，分离出组分Ⅱ，其沉淀物进行低pH/低浓度胃蛋白酶处理，或结合阳离子交换/阴离子交换色谱步骤来减少或去除杂质。在该工艺中，组分Ⅱ中生产得到的IVIG含量在3~4g/L。为提高产量，部分企业对工艺进行了改进，其中一种方法是通过降低组分Ⅲ和组分Ⅱ沉淀过程中造成的损失，采取在组分Ⅱ+Ⅲ中引入改进的低pH灭活和或S/D灭活、离子交换等工艺步骤，改进工艺后IgG的含量可达4~4.5g/L［5］。无论使用何种工艺进行组分的分离及纯化，血液制品生产商均应对工艺开展充分研究，了解每步生产工艺对产品质量、安全性、有效性的影响，识别关键工艺参数及其控制范围，通过对中间体开展必要的检测，加强对生产工艺的过程控制。如在进行层析工艺时，除了对目标杂质的清除能力及产品质量的影响进行研究外，还应考虑对产品病*安全性是否有影响，如有影响应在缩小的代表性规模下开展病*清除能力研究，另外，研究中还应该考虑到填料不同循环次数的影响。2.3制剂生产工艺最初的IVIG制剂处方是在中性pH条件下将制剂冻干，这种制剂可在2~8℃保存2~3年，但这种制剂复溶后常含有IgG多聚复合物。而在pH为4.25的液体条件中IgG稳定性更高，因此目前最常见的IVIG制剂处方是利用山梨醇、糖（岩藻糖、葡萄糖）或氨基酸(甘氨酸、脯氨酸、异亮氨酸)作为稳定剂，pH范围为4.5~5.5。以蔗糖作为IgG稳定剂可能导致某些患者出现致命的肾功能衰竭，因此在制剂处方中被取代。对于制剂处方的研究，建议申请人在不同强制降解条件下开展研究，以便更灵敏地发现制剂处方是否稳定，另外，制剂处方的研究同时要考虑与直接接触包材的相容性问题。2.4病*灭活／清除工艺与冷乙醇沉淀法上游中分离得到的凝血纤维蛋白原、凝血因子Ⅷ、凝血因子Ⅸ等血浆来源的血液制品比较，经多步冷乙醇沉淀获得的IgG的病*安全性较高，一方面可能由于产品本身具有中和病*的抗体存在，另一方面IVIG生产过程中多步冷乙醇沉淀会对病*的清除发挥一定作用。但实际临床应用中还是有因免疫球蛋白输注而导致丙肝病*（hepatitisCvirus，HCV）传播的例子［3］，因此IVIG的病*安全性应高度重视。免疫球蛋白生产中至少应含有一步有效的病*灭活/去除工艺（病*滴度下降≥4log），血液制品生产者应结合实际工艺情况开展小规模的病*灭活/清除验证，选取代表性病*，并在验证范围内开展生产。为了提高产品的病*安全性，建议血液制品生产者在生产工艺中纳入两种不同原理的病*灭活/去除工艺。应该注意的是某些工艺步骤虽然不是有效的病*灭活/去除工艺，但对病*灭活/去除起作用（4log＞病*滴度下降≥1log），这些工艺步骤的变更可能对产品病*安全性带来风险隐患。用于免疫球蛋白病*灭活/清除的工艺有：低pH病*灭活（主要灭活包膜的病*）、巴氏灭活（灭活包膜病*并在一定程度上能灭活非包膜病*）、S/D灭活（主要灭活脂包膜病*）、辛酸处理（主要灭活脂包膜病*）及纳滤（包括15、20、35nm孔径的滤膜，可以去除包膜和非包膜病*）［5-8］。2.5质量控制目前，《中国药典》三部（版）［9］规定，对IVIG成品应该控制的质量属性包括：鉴别试验、物理检查（外观、渗透压摩尔浓度、可见异物、不溶性微粒、装量、热稳定性）、化学检定（pH、蛋白含量、纯度、糖及糖醇含量）、分子大小分布（排阻色谱法）、抗体效价（抗-HBs、白喉抗体）、激肽酶原激活剂、抗体补体活性、抗A和抗B血凝素、无菌检查、异常*性检查、热源检查。同时，生产者在实际研究中还应进行更多的质量研究，有利于产品开发、上市后工艺变更等整个生命周期的管理。2.5.1IgG亚型的分布由于不同亚型的IgG在抗*素、抗病*、抗菌等方面的生物学活性不完全相同［10］，因此不同的IgG亚型分布可能造成产品效价上存在一定差异。正常人血清IgG分布有一定的范围，通过检测产品中IgG亚型分布，血液制品生产商一方面可以了解生产工艺过程对IgG亚型分布产生的影响，另一方面当发生工艺变更时，便于更全面地对比生产工艺变更前后产品的改变。2.5.2Fc段功能的检测人体内有表达多种Fc片段的受体，包括激活受体（如FcγRⅠ、FcγRⅡA、FcγRⅡCandFcγRⅢA）和抑制受体（如FcγRⅡB），IVIG通过其Fc片段与不同受体作用，从而发挥不同的生理功能［11］。《中国药典》三部版［9］中要求对抗体补体活性进行检测，并非所有IgG亚型均具有补体活性，因此补体活性仅能反映特定型别IgG的Fc段活性，血液制品生产者可结合IgGFc片段的特性开展多种检测方法，如开展IVIG产品与不同Fc受体结合能力的检测。2.5.3FⅪ残留量的检测有研究报道，在乙醇沉淀的过程中可去除凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ，但凝血因子FⅪa等电点高（pI8.9~9.1），仅通过乙醇沉淀法较难将FⅪa中完全从IVIG中完全分离，而需要通过适宜的层析工艺将其去除［12］。国外研究者在来自8个不同厂家的29种IVIG产品中，发现有26种产品可缩短FⅪ缺乏血浆的凝血时间，其中14种产品促凝血活性高于在原料血浆的促凝血活性。因此，建议生产者对关键工艺过程中间品及终产品开展凝血能力检测，以便于了解工艺过程对凝血酶的清除能力。中间品中的凝血酶原含量可通过Westernblot或ELISA法进行检测，其活性可通过凝血酶生成试验（thrombingenerationassay，TGA）检测，而终产品中凝血酶活性可通过TGA、非活化凝血酶原时间试验（non-activatedpartialthromboplastintime，NaPTT）等方法检测［12］。2.5.4IgA和IgM含量的检测IgA和IgM作为产品相关物质，可能不同程度存在于免疫球蛋白产品中。与凝血因子不同，IgA和IgM生理功能上与IgG具有一定的关联性，因此不能单纯地认为产品中IgA和IgM的含量越少越好，某些含有高IgA和IgM的免疫球蛋白产品较常规免疫球蛋白产品具有更强的抗菌作用［13］。但IgM以聚体形式存在，因此较IgG具有更高的补体激活作用。而IgA缺陷患者使用含IgA的IVIG可能产生IgA抗体，会引起重症过敏性休克。《欧洲药典》9.0［14］要求IVIG中IgA的含量应经过监管机构批准。为了产品的安全性和有效性，建议申请人在工艺开发或工艺变更时