福州白癜风医院 http://news.39.net/bjzkhbzy/171221/5948909.html杂志名称：AnnRheumDis
影响因子：16.
文献题目：Quantitativeplanararrayscreenofproteinsuncoversnovelurinaryproteinbiomarkersoflupusnephritis
第一作者：KamalaVanarsa
通讯作者：ChandraMohan
作者单位：DepartmentofBiomedicalEngineering,UniversityofHouston
本实验所用产品：QAH-CAA-X00（定量检测人个蛋白抗体芯片）
实验样品：尿液样本
研究背景：
系统性红斑狼疮（SLE）是一种慢性自身免疫性疾病，近年来，大量的研究人员对其生物标记物进行研究。从生物样品中发现生物标志物是一项重要的工作，这些生物标志物无需采取侵入式方法即可获得，并且可以在患有或不患有狼疮性肾炎（LN）的SLE患者之间进行区分。有效的尿液标志物的发现可能会取代传统肾脏活检的金标准，可以极大地促进以频繁的间隔进行纵向监测，以便密切跟踪疾病的进展并相应地调整治疗方案。
以前用于生物标记物检测的大多数方法都采用了偏见性的原理，其基础是探索与SLE相关的既定病理生理学途径，例如炎症或生长因子途径。虽然有用，但这些方法限制了新型生物标志物及其相关途径的发现。近年来，几种方法已用于无偏性生物标志物筛选，包括质谱法和飞行时间串联质谱法。这些方法通常被高丰度的蛋白质所淹没，而使用了各种配体（例如抗体）的基于亲和力的方法有可能发现较低丰度的蛋白质。在这项研究中，研究者使用了抗体芯片来筛选和定量种蛋白质，以鉴定SLE患者的潜在尿液生物标志物。
1结果
1.1高通量抗体芯片筛选尿液差异蛋白
从24名受试者（HC=9，活跃SLE=15）中收集尿液样本，用于筛选种不同的人类蛋白质（QAH-CAA-X00,RayBiotech)。个蛋白质达到p0.05和FC2的显着性阈值（图1A，1B)。
种尿液蛋白质进行IPA分析，生成了22个网络，其中8个网络分别包含至少20种尿液蛋白质。这八个升高的尿蛋白网络包括与NFKB激活，p38丝裂原激活的蛋白激酶激活和AKT激活有关的途径（图1C–E）。
LN尿液中升高的NFKB调节蛋白包括TNF家族的多个成员，包括TNFRSF-11B（OPG），17（BAFF），1A，1B（TNFα）和8（CD30），以及TNFSF-14（LIGHT，HVEML）和18（GITRL），白介素1（IL-1）家族成员，IL-17和几种趋化因子，其中许多与多种自身免疫性疾病有关，包括狼疮。
1.2差异蛋白选择
使用更严格的标准来确定应该选择哪种尿蛋白，以便进行进一步验证。如图2A所示，FC5时，SLE尿液中有64种蛋白质升高，p0.05，SLE尿液中的标志物浓度超过pg/mg。其中，经过多次测试校正后，有54种蛋白质的q0.05。为了生成更具选择性的候选生物标记集，仅考虑FC15的蛋白进行进一步验证，从而将要验证的候选列表减少到34个。随机森林分析（RFA）也用于选择最能区分HC和SLE样品的尿蛋白（图2B）。
除去一些目前已经有人研究的蛋白，尿液中丰度过低以及有强线性相关性的蛋白，最终保留9种（Angptl4,FOLR2,GPC-5,L-selectin,PDGF-Rβ,PRX2,TGFβ?1,TPP-1andTSP-1）尿蛋白进行进一步验证。
1.3差异蛋白验证
ELISA验证使用了一个独立的队列，78名受试者（HC=16，SLE=17，ANR=16，AR=29）（图3）。
ELISA结果显示，与HC相比，AR患者尿Angptl4，FOLR2，GPC-5，L-selectin，PDGF-Rβ，PRX2和TSP-1均显着上调。此外，与ANR、SLE相比，AR患者尿Angptl4，FOLR2，L-selectin，TGFβ1，TPP1和TSP-1均显着升高，表明这些尿蛋白均指示活动性SLE患者的肾性狼疮。在图4中ROC进一步突出了这些尿蛋白在区分ANR和ARSLE或AR和非活性SLE之间的性能。如图4A所示，这些尿蛋白在区分AR与ANRSLE方面均优于传统的临床参数，例如抗dsDNA（AUC=0.58），C3（AUC=0.48）和C4（AUC=0.34）。接下来，使用lasso回归分析，将多种蛋白质合并为一组，以评估尿液蛋白质的任何特定组合是否显示出进一步的诊断潜力。如图4B所示，在将AR与ANRSLE区分时，尿液L-selectin，Angptl4和TPP1的组合表现出最佳的诊断潜力，AUC为0.97。
接下来进行多元回归分析，以评估测定的尿蛋白预测各种临床指标的程度。如图5A所示，基于线性回归分析，大多数测定的尿蛋白显示出与rSLEDAI，尿蛋白和/或PGA的显着关联。
1.4候选尿液生物标志物在追踪LN患者疾病活动中的表现
为研究候选尿液生物标志物在追踪LN患者疾病活动中的表现，对7例多次就诊的LN患者进行了尿Angptl4，L-selectin，TGFβ1和TPP1的检测。图6中的序列追踪图显示了这些蛋白质以及SLEDAI，rSLEDAI和uPCR随时间的波动。这些蛋白同时升高（标记为“
”），并随疾病活动的增加而升高（如SLEDAI或rSLEDAI指数或uPCR所反映）；而这些蛋白先于临床耀斑出现（标记为“p”）。如图6所示。在所有7名患者中，尿液L-selectin在SLEDAI或rSLEDAI恶化之前或同时发生，在图6中用“”和“p”符号标记。尿Angptl4在7例患者中有6例表现良好，在SLEDAI或rSLEDAI恶化之前或与此同时。尿液中的TGFβ1在7例患者中有5例在SLEDAI或rSLEDAI恶化之前或同时发生（图6），排名第三。在所有情况下，尿液生物标志物的波动远比尿蛋白的细微变化更为明显。在某些情况下，尿液生物标志物甚至在尿蛋白上升之前就显示出升高的迹象，并且与尿蛋白相比，其对疾病活动的追踪更好。
连续数据的统计分析证实，当连续跟踪LN疾病活动时，尿液L-selectin是疾病活动的最佳预测指标，其次是Angptl4和TGFβ1。
1.5LN肾脏内尿液候选生物标志物的表达
为了进一步探索LN肾脏内细胞水平上候选生物标志物的潜在来源，肾脏scRNA-seq获得了21例LN活检数据（图8A），并从24个独立的LN活检中的肾浸润免疫细胞获得了scRNA-seq数据（图8B）。这些蛋白质在LN肾脏中的表达谱强烈支持了LN尿液中升高的蛋白质可能起源于肾脏的假说。
结论：
高通量蛋白检测技术从出现改变了生物标记物发现研究的格局。质谱已用于最近的SLE研究中。但是，可能由于高丰度蛋白质（白蛋白，尿素，免疫球蛋白等）的信号遮盖而无法检测到低丰度蛋白质。相反，靶向蛋白质组学测定法（例如本研究中使用的抗体芯片）依赖于配体-蛋白质相互作用，从而有可能准确地检测和定量低丰度蛋白质。研究者使用该平台对LN尿液进行的筛选重新发现了几种已知在SLE或LN中上调的蛋白质，包括Adiponectin,Angiostatin,CD36,Ferritin,Galectin7,ICAM-1,IGFBP家族蛋白,MIF,Resistin,SA8,Siglec-5和VCAM-1，因此可以独立验证该方法学。在本研究中，并未采用这些标志物，因为大多数标志物已在文献中得到验证。取而代之的是，研究者专注于以前不涉及LN的新型蛋白质，并发现Angptl4，L-selectin和TGFβ1作为潜在的生物标志物，可用于追踪LN中的疾病活动。
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